Gäbe es eine Abkürzung des Jahres, dann wäre PCR schon seit einigen Jahren ein heißer Kandidat dafür gewesen. Grund genug besteht jedenfalls allemal, uns an dieser Stelle ausführlicher mit der PCR auseinander zu setzen.
Die Polymerase–Ketten–Reaktion (PCR = Polymerase Chain Reaction) ist eine etablierte molekulargenetische Methode zum empfindlichen Nachweis und der Quantifizierung von Nukleinsäuren (DNA, RNA). Ihre hohe Empfindlichkeit beruht auf dem Prinzip der zyklischen Vervielfachung (Amplifikation) von Ziel-Nukleinsäuren. Wie funktioniert das genau? Im Reaktionsansatz wird, sofern vorhanden, die Ziel-Nukleinsäure „erkannt“.
Durch eine zyklische Abfolge von Temperaturerhöhung und Temperaturerniedrigung wird sodann diese Nukleinsäure vervielfacht. Die ursprüngliche Anzahl der Ziel- Moleküle wird dabei im ersten Zyklus verdoppelt, im zweiten Zyklus vervierfacht, im dritten Zyklus verachtfacht und so weiter. Eine übliche Anzahl von PCR Zyklen ist zum Beispiel die 30.
Was sagt der Ct-Wert aus?
Das bedeutet, dass die Zahl der ursprünglich vorhandenen Moleküle 30 mal hintereinander verdoppelt wurde. Daraus erklärt sich auch das zunächst etwas paradox erscheinende Prinzip, dass ein hoher Ct-Wert (cycle threshold) einer einer niedrigeren Ausgangskonzentration der Moleküle entspricht als ein entsprechend kleinerer Wert.
Warum eignet sich die PCR besonders gut zum Nachweis von Nukleinsäuren?
Nukleinsäuren bestehen aus einem Zucker (Ribose bei RNA oder Desoxyribose bei DNA) – Phosphat – Gerüst, an dem die so genannten Basen „hängen“. Im Wesentlichen sind das Adenin (A), Thymin (T), Guanin (G) und Cytosin (C) in der DNA. In der RNA ist das Thymin durch Uracil (U) ersetzt. Wie im Infokasten verdeutlicht, kann ein Bestandteil der PCR Reaktion, der so genannte Primer, nun die DNA, die nachgewiesen oder analysiert werden soll, spezifisch erkennen. Damit läuft die PCR Reaktion ab oder nicht ab, je nachdem ob eine entsprechende Sequenz vorhanden ist.
Funktionsweise PCR
Die PCR beruht darauf, dass DNA – Moleküle Doppelstränge ausbilden können. Dabei ist die Basensequenz des Doppelstranges bekannt, sofern man beziehungsweise die Zelle die Sequenz jeweils eines Stranges kennt, weil sich die Basen nur ein eindeutiger Weise gegenüberliegen können. Das bedeutet A liegt gegenüber von T, G gegenüber von C bzw. jeweils umgekehrt. Die Zelle verfügt über Werkzeuge, um den gegenüberliegenden Strang zu „rekonstruieren“. Diese Werkzeuge werden als DNA Polymerase bezeichnet. Sie sind natürlich nicht als Hilfsmittel für die Molekulargenetik entstanden, sondern in Vorbereitung der Zellteilung damit beschäftigt, die DNA der Zelle zu verdoppeln.
Voraussetzung sind dabei kurze Stücke von DNA mit bekannter Sequenz, mit denen jeweils die Rekonstruktion startet, die sogenannten Primer. In einem PCR – Zyklus passiert dann das Folgende: der DNA Doppelstrang wird geöffnet (Denaturierung = Temperaturerhöhung). Danach wird die Temperatur wieder erniedrigt. Sofern vorhanden, findet der Primer seine Zielsequenz. Damit ist dann wiederum an der entsprechenden Stelle der Startpunkt für die Rekonstruktion des Doppelmoleküls gegeben. Aus den beiden Einzelsträngen nach Trennung entstehen zwei Doppelstränge. Aus diesen entstehen durch Temperaturerhöhung zu Beginn des nächsten Zyklus vier Einzelstränge.
Daneben wird benötigt die DNA Polymerase zur Neusynthese der neu entstehenden Fragmente und es werden die Primer benötigt als wichtige Startpunkte und Erkennungswerkzeuge der PCR Reaktion. Schließlich bedarf es noch eines Vorrates von DNA-Bausteinen, damit die Synthese entsprechenden Nachschub hat. Damit kann die PCR dann beginnen (Temperaturerhöhung). Danach wird die Temperatur wieder erniedrigt. Sofern vorhanden, findet der Primer seine Zielsequenz. Damit ist dann wiederum an der entsprechenden Stelle der Startpunkt für die Rekonstruktion des Doppelmoleküls gegeben. Aus den beiden Einzelsträngen nach Trennung entstehen zwei Doppelstränge.
Mit diesen Informationen können wir jetzt den Werkzeugkasten der PCR bestücken: Benötigt wird das PCR Gerät selbst, das die Abfolge von Temperaturerhöhung und -erniedrigung d.h. die eigentlichen Zyklen, sicherstellt. Damit kann die PCR dann beginnen.
Siegeszug der PCR
Die besondere Bedeutung der PCR als molekulargenetisches Verfahren wurde auch durch die Vergabe des Nobelpreises 1992 an Kay Mullis gewürdigt. Was erklärt aber nun den besonderen Siegeszug der PCR in der Diagnostik?
Wenn die Reaktionsparameter richtig gewählt werden und die Zielsequenz der Nukleinsäure beziehungsweise die zugehörigen Primer richtig ausgefüllt sind, dann ist die PCR sehr spezifisch und, verbunden durch die Applikation der DNA, auch sehr sensitiv. Die PCR ist gleichermaßen zu qualitativen und quantitativen Analyse von Nukleinsäuren geeignet. Ihre besondere Stärke spielt sie immer dann aus, wenn nur kleine Mengen der zu untersuchenden Nukleinsäuren zur Verfügung stehen. Die zu untersuchende Nukleinsäure kann dabei DNA oder RNA sein. Im zweiten Fall muss dabei der eigentlichen PCR eine Umschrift (sog. reverse Transkription) der RNA in DNA vorausgehen. Diese Variante wird als RT-PCR (für Reverse Transcriptase-PCR) bezeichnet. Oft wird die PCR auch in Kombination mit anderen molekulargenetischen Untersuchungsverfahren verwendet, so dass die PCR zur Vermehrung der Nukleinsäuren dient, deren nähere Untersuchung dann mit einer weiteren Methode, z. B. der DNASequenzierung, erfolgt.
Allein oder in Kombination sind wichtige Einsatzgebiete der PCR der Erregernachweis wie aktuell des SARS-CoV-2, forensische Anwendungen wie die Untersuchung von Tatortspuren und Vaterschaftsbegutachtung oder Untersuchung auf Genvarianten im Rahmen humangenetischer Diagnostik. Auch eine Quantifizierung der Nukleinsäuren ist mit Varianten der PCR (qPCR = quantitative PCR) möglich. Wir kennen das etwa von der SARS-CoV-2 Diagnostik, bei der der Ct-Wert ein Maß für die Menge an Viruspartikeln in der untersuchten Probe ist.
Gemeinsam ist allen Anwendungen, dass die PCR aus den o.g. Gründen mit sehr geringen Mengen der zu untersuchenden „Ausgangsnukleinsäure“ auskommt.
Falsch positiv Befund
Diese hohe Sensitivität hat allerdings auch ihren Preis, denn selbst kleinste Mengen von kontaminierender DNA, die versehentlich in den Reaktionsansatz gelangen, können zu einem positiven Signal führen und damit einem falsch positiven Befund. An die „Laborumgebung“, in der die Tests stattfinden, sind daher hinsichtlich Kontaminationsschutz besondere Bedingungen zu stellen.
In jüngster Zeit wird versucht, diesen Problemen durch besonderes Containment wie der Verwendung geschlossener Cartridges Rechnung zu tragen, um so vorsichtig den Weg hin zu Point of Care Anwendungen zu öffnen.
Zusammenfassung
Kurzum, die PCR ist in der Diagnostik bereits heute eine etablierte und extrem wichtige molekulargenetische Methode, 5 deren Anwendung in vielen medizinischen Bereichen indes noch viel Spielraum nach oben hat. Ein optimistischer Blick in die Zukunft der PCR voller Spannung, was da noch kommt, ist berechtigt.
